导语

基因突变是恶性肿瘤、感染性疾病发生发展的重要诱因，但现有测序、ARMS-PCR 等主流检测手段普遍存在费用高、操作繁琐，难以高效检出未知位点突变等短板。近期，由我院颜贝副研究员牵头，联合武汉轻工大学、华中科技大学科研团队攻关的原创研究成果正式刊发于国际知名期刊《Chemical Engineering Journal》。团队首创反向楔形（NW）核酸调控元件，构建荧光开启型检测新体系，依托常温无酶的DNA链置换反应，实现多基因、多位点未知突变便捷筛查，为临床精准诊断带来新思路。

论文简介

论文题目：基于反向楔形元件的“点亮式”探针系统的构建与应用

合作单位：宁夏医科大学总医院、武汉轻工大学、华中科技大学

一、临床检测现存痛点

1. NGS、Sanger测序精准但价格昂贵、操作繁琐，难以基层普及；

2. ARMS-PCR、常规荧光探针仅能检出已知位点突变，新发未知突变无法筛查；

3. 传统荧光淬灭试剂信号差异小，结果判读困难；COLD-PCR需要精准控温，实验门槛高。

二、研究设计

研究选取PTEN（多系统肿瘤易感基因）、BRCA1（乳腺/卵巢癌易感基因）、生殖支原体（泌尿感染致病菌）三类靶点；先利用人工合成核酸完成元件筛选与反应条件优化，最终筛选出最优元件NW10&10；进一步选取子宫内膜癌、乳腺癌等临床样本，联合不对称 PCR 将双链基因组DNA转为单链，并完成临床样本验证。

三、核心研究成果

1. 原理创新，荧光分型辨识度高

反向楔形元件可与野生型DNA形成特征楔状三链复合体，抑制链置换反应从而无荧光信号；DNA发生单碱基错配突变后，无法稳定形成上述复合结构，链置换正常启动并产生荧光信号，显著改善传统淬灭法信号区分度不足的缺陷。

2. 灵敏度优异，可检出低频突变

体系突变检出限可达1%～5%，即便待测片段延长至113 nt、两端附带非靶向冗余序列，仍稳定检出5%突变丰度，适配临床微量标本检测。

3. 适用性广，多类单点突变均可识别

元件结合的10个碱基区间内，除P1位点采用双信号比值辅助判读外，G>A、G>C、G>T等各类单碱基替换突变均可检出，在肿瘤、致病微生物基因中验证有效。

4. 临床可靠性佳，结果与测序相符

1%～50%梯度丰度肿瘤样本全部检出；20例乳腺癌标本可精准区分野生、杂合及纯合突变，分型结果与NGS测序结果一致。

5. 底物切换便捷，有效节约检测成本

更换待测靶基因无需重新合成全套荧光探针，仅替换20 nt长度反向楔形元件即可，大幅压缩耗材与优化成本。

四、应用前景与现存局限

应用价值

1. 临床应用：适用于乳腺、妇科肿瘤早筛与生殖支原体耐药突变检测，还可拓展用于流感、新冠等病原体突变检测，适配基层POCT快速筛查。

2. 科研创新：建立DNA链置换调控新策略，完善荧光型核酸探针设计体系。

3. 产业化潜力：反应常温自发进行，无需酶制剂与精密控温设备，试剂便于冻干制备，有利于后续诊断试剂盒研发。

现存局限

1. 现阶段仅验证单碱基替换突变，插入、缺失、移码突变仍需后续研究；

2. 临床验证样本偏少，尚未在血浆、痰液等体液样本测试，后续拟开展多中心临床研究。

小结

本技术灵敏度高、使用成本低、适用范围广，填补未知突变低成本检测空缺。课题组将持续优化方案，加快临床转化落地，赋能基层肿瘤与感染性疾病精准筛查。